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Dentro de los cuatro niveles del Museo, se encuentran dos amplias salas de arte europeo y arte de la Nueva España que constituyen la exposición permanente del MUSA. En ellas se presentan obras de los periodos medieval, renacentista, barroco, virreinal, neoclásico, romántico y moderno, así como piezas de artes decorativas realizadas en marfil, plata y porcelana.El recorrido permanente de arte abarca 300 magníficas obras en dos exhibiciones principales: El Arte del México Virreinal y El Arte Europeo.

En la pinacoteca novohispana se exhiben importantes retratos como Sor María Margarita Marcelina del pintor Miguel Cabrera (1695-1768) y obras de temática religiosa como la Virgen Dolorosa , hermosa pintura sobre lámina con marco repujado de plata y el óleo del siglo XVIII titulado Ecce Homo. El gusto barroco por los símbolos y alegorías se observa en la estupenda pintura Alegoría de la Suma Teológica de Santo Tomás de Aquino también del XVIII.

Las obras europeas provienen principalmente de España y datan de los siglos XIV al XIX. El recorrido sigue la evolución de estilos desde el gótico, renacentista, manierista, barroco hasta el neoclásico. En la primera parte pueden apreciarse pinturas sobre tabla hispano flamencas de los siglos XIV al XVI. Del siglo de oro español se exhiben la Virgen de la Inmaculada Concepción, obra del sevillano Bartolomé Esteban Murillo (1617–1682) y San Francisco de Asís frente al crucifijo de la capilla de San Damián, atribuido a Francisco de Zurbarán (1598-1664). La historia nacional y regional ha encontrado lugar en el Museo Arocena a través de dos exhibiciones: México en el Tiempo y Crónica de la Laguna, ambas ubicadas en la última planta del edificio. Este guión se complementa mediante el apoyo de distintos recursos museográficos como videos e interactivos sobre cada tema.